PRÁCTICA 03

TINCIONES EN EXTENSIONES SANGUÍNEAS

Martes, 26 de Octubre de 2021

OBJETIVO

1.- Practicar la realización de extensiones con sangre periférica.

2.- Practicar la tinción de extensiones (tinción May Grünwald-Giemsa y Panóptica rápida).

3.- Obtener extensiones teñidas para utilizarlas en futuras prácticas.

FUNDAMENTO

Extensiones de sangre periférica:

La extensión sanguínea se realiza recubriendo parcialmente un portaobjetos con una gota de sangre, de manera que las células se dispongan dando lugar a una monocapa uniforme. El procedimiento de obtención más habitual es mediante la técnica del portaobjetos en cuña, para la cual se necesitan dos portaobjetos de vidrio limpios de 7,5 x 2,5 cm, preferentemente de alta calidad y que tengan los bordes biselados. Uno de ellos se utilizará como soporte y el otro como extensor.

Los factores que influyen en la calidad de la extensión son:

Estado del portaobjetos
Muestra de sangre

Volumen de sangre utilizado
Anticoagulación de la sangre

Ejecución de la técnica

Distribución de la sangre por el canto del extensor
Ángulo del extensor
Velocidad de deslizamiento del extensor
Presión ejercida con el extensor

Tinciones:

Las tinciones hematológicas se realizan para colorear las diversas estructuras de las células sanguíneas, aumentando así el contraste entre ellas y el medio que les rodea, y facilitando la identificación de los diferentes tipos celulares al microscopio.

Tinción May Grünwald-Giemsa:

Esta tinción se basa en la combinación de dos colorantes que se combinan con los distintos componentes celulares. Estos colorantes son:

May Grünwald:

Solución de eosina (colorante ácido) y azul de metileno (colorante básico) en metanol.
Tiñe ácidos nucleicos y estructuras celulares basófilas.

Giemsa:

Mezcla de eosina y derivados de azul de metileno (azur I y azur II)
Tiñe hemoglobina, otras proteínas básicas y los gránulos citoplasmáticos de leucocitos eosinófilos.

Tinción Panóptica rápida:

Esta tinción se basa en la combinación de las técnicas polícromas básicas (May Grünwald-Giemsa y Wright) para conseguir una mayor rapidez. Es muy utilizada en laboratorios de urgencias. Usa 3 reactivos:

Solución fijadora (metanol).
Colorante ácido tamponado (eosina)
Colorante básico tamponado (azul metileno)

MUESTRAS, REACTIVOS, MATERIAL Y EQUIPOS

MUESTRAS

Sangre periférica

REACTIVOS

Agua destilada
Tinción May Grünwald
Tinción Giemsa

MATERIAL

Portaobjetos
Pipeta graduada 5 ml
Vasos precipitados
Probeta 100 ml
Puente de tinción
Cubeta
Pinzas de madera
Papel de filtro
Rotulador permanente

PROCEDIMIENTO

1.- Preparar el material en la mesa de trabajo..

2.- Homogeneizar el tubo de sangre.

REALIZACIÓN DE 3 EXTENSIONES SANGUÍNEAS CORRECTAS

1.- Depositar una gota de sangre de aproximadamente 3 mm (10-15 µl) en el portaobjetos soporte, cerca de uno de los extremos.

2.- Colocar el portaobjetos extensor sobre el soporte, por delante de la gota de sangre, formando cuña en un ángulo de 35-45º.

3.- Deslizar el portaobjetos extensor un poco hacia atrás para que su borde entre en contacto con la gota de sangre. de esta forma la sangre se distribuye por capilaridad a lo largo del extremo del portaobjetos.

4.- Deslizar el portaobjetos extensor sobre toda la longitud del portaobjetos soporte en un movimiento rápido, suave y contínuo, manteniendo en todo momento el ángulo de 35-45º entre ambos y una presión homogénea. De esta manera, la gota de sangre se extiende uniformemente, formando una monocapa de células que ocupa, aproximadamente, entre ⅔ y ¾ de la longitud del portaobjetos soporte.

5.- Dejar secar la extensión al aire.

6.- Repetir con los otros 2 portaobjetos hasta conseguir extensiones de buena calidad.

TINCIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA

1.- Preparar las tinciones:

10 ml de May Grünwald
20 ml de May Grünwald diluída a ½.
10 ml de Giemsa diluída a 1/10 (ya preparada)

2.- Preparar el puente de tinción y colocar en él las extensiones.

3.- Teñir 2 de las extensiones por inundación (tinción May Grünwald) con la pipeta Pasteur y dejar actuar 2 minutos.

4.- Pasados los 2 minutos, volcar las extensiones para escurrir el exceso de tinta. Volver a teñir por inundación con la tinción diluída (May Grünwald diluída a ½) y dejar actuar 1 minuto.

4.- Volcar las extensiones para escurrir el exceso de tinta y lavar con agua destilada. Escurrir y dejar secar.

TINCIÓN PANÓPTICA RÁPIDA

1.- Preparar la solución fijadora, la tinción ácida y la tinción básica en 3 vasos de precipitados.

2.- Con las pinzas de madera coger la extensión restante y realizar 5 inmersiones de 1 segundo en la solución fijadora. Escurrir sobre papel de filtro.

3.- Realizar 5 inmersiones de 1 segundo en la tinción ácida (rosa). Escurrir.

4.- Realizar 5 inmersiones de 1 segundo en la tinción básica (azul). Escurrir.

5.- Lavar la extensión con agua destilada, escurrir y dejar seca.

RESULTADOS

Las extensiones han quedado con algunas rayas debido a una velocidad de deslizamiento del extensor no constante. Las tinciones se han realizado correctamente.

OBSERVACIONES

El extensor se queda enganchado a los bordes al realizar la extensión. Esto puede deberse a que los portaobjetos no son de alta calidad y a que están ya muy usados.

IMÁGENES